Novel Procedure for Large-Scale Purification of Atelocollagen by Selective Precipitation

Abstract

This paper describes a novel procedure for the purification of raw atelocollagen solutions, based on a multi-stage selective precipitation of the protein fractions using polyethylene glycols (PEGs) as crowding agents. The precipitation selectivity was provided by the simultaneous effect of pH and crowding agents. Two adjuvants were added to improve the precipitation selectivity: ethanol and trimethylamine-N-oxide (TMAO). An optimal composition of the crowding mixture, consisting of 23 % PEG 400, 61 % PEG 6000 and 16 % PEG 20000, induced a „screening” effect within the isoelectric range of atelocollagen. The optimal recipe for the screening of an atelocollagen solution obtained at plant scale was: 80 g/L crowding mixture, 0.2 molar TMAO, 0.3 molar ethanol, pH = 3.8, processing time: 4-6 hr at 5 ÷ 10 °C. The proposed procedure is useful in the manufacture of colloidal collagen solutions, in order to replace or to facilitate expensive and denaturing operations, like ultrafiltration.ResumenEste trabajo describe un procedimiento novedoso para la purificación de soluciones crudas de atelocolágeno [extracto acuoso de colágeno por uso de proteasas], basado en precipitaciones selectivas en varias etapas de fracciones proteínicas por medio de glicoles polietilénicos (PEGs) como agentes de hacinamiento [a la solubilidad]. La selectividad de precipitación fue efectuada por el uso simultáneo de agentes de hacinamiento y pH. Dos adyuvantes fueron añadidos para incrementar la selectividad de la precipitación: etanol y óxido-N-trimetíl amina (TMAO). La composición óptima de la mezcla de hacinamiento constituida por 23% PEG 400, 61% PEG 6000 y 16% de PEG 2000, indujeron un effecto de apantallamiento en el rango isoeléctrico de la solución de atelocolágeno. La óptima composición para el apantallamiento de una solución de atelocolágeno a escala de planta fue: 80 g/L de las mezcla de hacinamiento, 0,2 molar TMAO, 0,3 molar etanol, pH=3,8, y tiempo de procesamiento: 4-6 horas.entre 5-10°C. El procedimiento propuesto es útil en la preparación de soluciones colagénicas coloidales, en vista de reemplazar o facilitar costosas operaciones con riesgo de denaturación, como lo es el de la ultrafiltración.